Biosensory — urządzenia wykorzystujące cząsteczki biologiczne do wykrywania obecności substancji docelowej — mają ogromny potencjał wykrywania biomarkerów chorób, cząsteczek w działaniu w różnych procesach biologicznych lub toksyn i innych szkodliwych substancji w środowisku. Jednym z bardziej powszechnych typów są fluorescencyjne biosensory, składające się z wiążącej cel biocząsteczki przyłączonej do cząsteczki sondy, która emituje światło fluorescencyjne. Jednak fluorescencyjne biosensory są zazwyczaj odczynnikami o niskim kontraście, ponieważ ich fluorescencyjne sondy są zawsze „włączone”, a niezwiązane cząsteczki biosensora muszą zostać wypłukane, zanim będzie można wykryć dokładny sygnał.
Dużym krokiem naprzód są „aktywowane wiązaniem fluorescencyjne biosensory” (nanosensory) o wysokim kontraście, które świecą tylko wtedy, gdy zwiążą się ze swoją cząsteczką docelową. Jednak tworzenie takich nanosensorów jest trudne, ponieważ skuteczne wiązanie docelowe i włącznik fluorescencji muszą zostać połączone w małym pakiecie cząsteczkowym, który można również wydajnie dostarczać do różnych typów próbek i ekonomicznie produkować na dużą skalę.
Teraz zespół badawczy współpracujący z Instytutem Wyssa na Uniwersytecie Harvarda, Harvard Medical School (HMS), MIT i Uniwersytetem Edynburskim w Wielkiej Brytanii opracował platformę biologii syntetycznej, aby usprawnić odkrywanie, ewolucję molekularną i opłacalną produkcję małych i wysoce wydajnych nanosensorów, które mogą wykrywać określone białka, peptydy i małe cząsteczki, zwiększając ich fluorescencję nawet 100-krotnie w czasie krótszym niż sekunda. Jako kluczowy komponent platforma wykorzystuje nowe aminokwasy fluorogeniczne (FgAA), które można zakodować w wiążących się z celem sekwencjach małych białek (wiążących) za pomocą innowacyjnej metodologii, która umożliwia in vitro ekspansja kodu genetycznego. Poprzez proces przesiewu czujników o wysokiej przepustowości, walidacji i ukierunkowanej ewolucji platforma umożliwia szybką i ekonomiczną transformację wiązań białkowych w nanosensory o wysokim kontraście do szerokiego zakresu zastosowań w badaniach podstawowych, monitorowaniu środowiska, diagnostyce medycznej i rozszerzonej terapii. Wyniki opublikowano w Komunikacja przyrodnicza.
„Od dawna pracujemy nad rozszerzeniem kodu genetycznego komórek, aby wyposażyć je w nowe możliwości, które umożliwią prowadzenie badań, prowadzenie biotechnologii i prowadzenie medycyny w różnych dziedzinach. Niniejsze badanie stanowi bardzo obiecujące rozszerzenie tych działań in vitro„, powiedział George Church, Ph.D., członek Wydziału Głównego Wyss, który kierował badaniem. „Ta nowatorska platforma biologii syntetycznej rozwiązuje wiele przeszkód, które stały na drodze ulepszania białek za pomocą nowych chemikaliów, czego przykładem są bardziej wydajne natychmiastowe biosensory, i jest gotowa wpłynąć na wiele obszarów biomedycznych”. Church jest liderem Platformy Biologii Syntetycznej Instytutu Wyss, a także profesorem genetyki Roberta Winthropa na HMS i profesorem nauk o zdrowiu i technologii na Uniwersytecie Harvarda i MIT.
Białko plus rusztowanie równa się nanosensor
Zespół, kierowany przez współautora i współautora korespondencyjnego Erkina Kuru, Ph.D. z grupy Churcha, opierał się na wcześniejszym odkryciu, że FgAA mogą przekształcać znane wiążące białka w czujniki optyczne, których fluorescencja jest włączana, gdy ich FgAA jest wciśnięty między sekwencję wiążącą a cząsteczkę docelową. Naukowcy z Wyss współpracowali z współautorem korespondencyjnym Marcem Vendrellem, Ph.D., profesorem na Uniwersytecie Edynburskim i ekspertem w dziedzinie chemii translacyjnej i obrazowania biomedycznego, nad badaniem, z którym Kuru dzielił wczesne zainteresowanie FgAA.
Zaczynając od pandemii, zespół najpierw wyobraził sobie „natychmiastową diagnostykę COVID-19” i skupił się na miniaturowym, zmodyfikowanym przeciwciele (nanobody), które wiąże się z białkiem Spike SARS-CoV-2 na powierzchni wirusa. Stworzyli setki wariantów łącznika, w którym zasadniczo zmontowali FgAA poprzez chemiczne łączenie aminokwasów cysteiny lub lizyny, które zostały genetycznie wprowadzone do pozycji, o których wiadomo, że są w bliskim kontakcie z celem Spike, z jednym z 20 różnych chemicznych rusztowań fluorogenicznych. Za pomocą prostego testu wiązania wybrali warianty fluorogeniczne, które wytworzyły największy wzrost fluorescencji w ciągu milisekund po związaniu z celem.
Następnie zastosowali ten sam proces, aby skonstruować nanosensory z nanobodies lub mini-białek, które wiążą się z różnymi miejscami docelowymi SARS-CoV-2, a także z szeregiem innych celów molekularnych, w tym receptorem czynnika wzrostu komórek EGFR istotnym dla raka, peptydem znacznika ALFA używanym przez biologów komórkowych do śledzenia białek w komórkach i hormonem stresu kortyzolem. Co ważne, nanosensory skutecznie sygnalizowały również obecność swoich celów w ludzkich komórkach i żywych bakteriach pod mikroskopem, co dowodzi ich przydatności jako skutecznych narzędzi obrazowania.
Ewolucja nanoczujników
Pomimo swojego potencjału, pierwsza wersja platformy była ograniczona przez pracochłonny i czasochłonny proces obejmujący wiele etapów oczyszczania wytworzonych sekwencji wiążących. „Chcieliśmy znacznie rozszerzyć naszą przestrzeń projektowania molekularnego, zwiększając możliwości platformy w zakresie wysokiej przepustowości” — powiedział Kuru. „Aby to osiągnąć, umożliwiliśmy rybosomowi, który naturalnie syntetyzuje wszystkie białka w komórkach, wykonanie większości pracy w zaprojektowanym procesie bezkomórkowym”.
W wersji 2.0 swojej platformy zespół prefabrykował tzw. „syntetyczny aminokwas” z fluorogenicznym rusztowaniem już do niego wstępnie przyłączonym. Syntetyczne aminokwasy już udowodniły swoją wartość w terapii, takiej jak lek na odchudzanie Ozempic; jednak nie mogą być łatwo włączone do sekwencji białkowych, ponieważ nie ma naturalnego mechanizmu, który mógłby je obsłużyć przez rybosom. „Aby pokonać tę przeszkodę, ponownie przypisaliśmy rzadko używany kodon w uniwersalnym kodzie genetycznym za pomocą nowej chemii ekspansji genetycznej, tak aby mógł kodować syntetyczne aminokwasy, takie jak nasze prefabrykowane niestandardowe FgAA. Zasadniczo dostosowaliśmy proces syntezy białek do budowy aktywowanych wiązaniem fluorescencyjnych nanosensorów” — powiedział współautor pierwszego artykułu dr Jonathan Rittichier, który współtworzył tę metodę.
Ich nowy proces nie tylko umożliwił badaczom produkcję milionów kandydatów na nanosensory na raz, ale także pomógł przyspieszyć późniejsze testowanie nanosensorów, ponieważ całą mieszankę syntezy można było bezpośrednio połączyć z cząsteczką docelową lub dodać do żywych komórek bez dodatkowego oczyszczania. Teraz mogli badać setki wariantów w ciągu dnia, a nie kilkadziesiąt w ciągu kilku tygodni. Podkreślając moc zaawansowanej platformy, odkryli określoną pozycję do kodowania swoich FgAA w oryginalnym wiązaniu nanocząsteczek SARS-CoV-2, co niespodziewanie zaowocowało nanosensorem o wyższym powinowactwie niż ich oryginalny nanosensor COVID-19 po kontakcie z białkiem docelowym Spike.
Wreszcie, ponieważ znacznie zwiększyłoby to potencjał tworzenia lepszych nanoczujników, zespół wykorzystał swoją platformę do optymalizacji samej sekwencji nanociał. Wykorzystali klasyczny proces biologii syntetycznej znany jako „ewolucja ukierunkowana”, w którym białka są optymalizowane poprzez iteracyjne cykle projektowania-budowy-testowania, które wykorzystują wersje białka o maksymalnych możliwościach zidentyfikowanych w jednym cyklu jako podstawę do znalezienia jeszcze lepszych w kolejnym. Zaczynając od najlepszego nanoczujnika, który wcześniej zaprojektowali, aby natychmiast wykrywał białko Spike oryginalnego szczepu SARS-CoV-2, Kuru, Rittichier i zespół stworzyli rozbudowane biblioteki nanociał obejmujące warianty, które utrzymywały niestandardowe FgAA w oryginalnej pozycji, ale miały wiele standardowych aminokwasów w innych krytycznych pozycjach zastąpionych strukturalnie innymi. Ewolucja najlepszych z nich doprowadziła ich do nowych nanoczujników o rzędach wielkości wyższych powinowactwach wiązania do białka Spike. Co ciekawe, wykorzystując zmodyfikowaną wersję tego systemu ukierunkowanej ewolucji, naukowcy odkryli nanoczujniki, które były w stanie selektywnie wykrywać różne nowsze warianty Omikronów.
„To ważny krok naprzód w naszych możliwościach szybkiego projektowania niedrogich fluorescencyjnych biosensorów do monitorowania chorób w czasie rzeczywistym i z ogromnym potencjałem do diagnostyki i medycyny precyzyjnej” — powiedział Vendrell. Kuru dodał: „możemy również włączać syntetyczne aminokwasy o wielu innych funkcjonalnościach do wszelkiego rodzaju białek, aby tworzyć nowe terapie i znacznie szerszy zakres narzędzi badawczych”. Rzeczywiście, Kuru i współautorzy Helena de Puig, Ph.D. i Allison Flores, wraz z Churchem i starszym autorem oraz członkiem Wydziału Głównego Wyss Jamesem Collinsem, Ph.D., również rozpoczęli projekt AminoX Instytutu Wyss, który wykorzystuje platformę do opracowywania nowych terapii.
„Ta niezwykle innowacyjna praca umożliwiająca stworzenie nowej i potężniejszej generacji aktywowanych przez wiązanie biosensorów pokazuje niezwykłe możliwości biologii syntetycznej. Zespołowi Wyss udało się opracować fundamentalny proces biologiczny w formie platformy o ogromnym potencjale ostatecznego rozwiązania wielu problemów diagnostycznych i terapeutycznych” — powiedział Donald Ingber, MD, Ph.D., dyrektor założycielski Wyss, który jest również Judah Folkman Profesor biologii naczyniowej w HMS i Boston Children’s Hospital, a także Hansjörg Wyss Profesor inżynierii inspirowanej biologią w SEAS.
Dodatkowymi autorami badania są Subhrajit Rout, Isaac Han, Abigail Reese, Thomas Bartlett, Fabio De Moliner, Sylvie Bernier, Jason Galpin, Jorge Marchand, William Bedell, Lindsay Robinson-McCarthy, Christopher Ahern, Thomas Bernhardt i David Rudner. Badanie zostało wsparte przez Wyss Institute Validation Project, US Department of Energy Grant (nagroda nr DE-FG02-02ER63445) i ERC Consolidator Grant (nagroda nr DYNAFLUORS, 771443), a także stypendium Life Science Research Foundation Fellowship to Kuru.
